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在上一期重新编码遗传密码的过程中（一）提到Peter Schultz团队通过引入生物正交的tRNA/氨酰-tRNA合成酶，首次实现了非天然氨基酸在体内的定点整合与大肠杆菌配对。目前，舒尔茨等科学家可以通过这种方法将200多种非天然氨基酸整合到蛋白质中，这为研究蛋白质结构和功能提供了极大的便利，例如在蛋白质中引入荧光标记或其他标签，或者实施光笼化。 （Photocaging）实验，通过用光敏基团覆盖实验蛋白质使其失活。该蛋白在特定光激发后恢复其功能，可用于研究生物过程和生物系统的时空调控。

当有机体突破自然限制，拥有20多种氨基酸时，会是什么样子？早期研究表明，在44以上的最简单培养基中，大肠杆菌的生长速度会显着下降，添加蛋氨酸可以部分缓解这种情况。高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(MetA) 是一种主要参与蛋氨酸合成的酶，在40C 以上不稳定。 Schultz团队将MetA催化中心外的大部分位点（261/308）突变为琥珀终止密码子TAG，形成文库，并将该文库与含有琥珀抑制子tRNA/aaRS的多特异性琥珀无义抑制子tRNA/氨酰基对进行比较。 -tRNA 合成酶(aaRS) 对) 质粒共转化到大肠杆菌JW39731 (metA) 突变株中。请注意，琥珀抑制子tRNA/aaRS 对与宿主tRNA/aaRS 对正交。将转化菌株置于液体基本培养基中。 44C 培养20 至40 小时后，将细胞铺板，选择单克隆并测序。最后发现，F21TAG被非天然氨基酸（对苯甲酰苯基）丙氨酸（pBzF）取代后的MetA突变体的Tm值增加了21（Tm，熔解温度表示蛋白质稳定性）。将F21TAG metA突变体和相应的tRNA/aaRS对（pEVOL-pBzF）共转化到大肠杆菌metA突变株中，并在含有1mM pBzF的培养基中与野生型大肠杆菌平行培养。可以看到突变株比野生株生长得更快。

通过引入非天然氨基酸来改变蛋白质性能的案例有很多。除了上述通过引入非天然氨基酸来提高蛋白质的热稳定性外，还有对环肽、抗体、酶和噬菌体进行修饰以提高亲和力。催化活性和适应性等

高热稳定性MetA的筛选

除了对大肠杆菌中的遗传密码进行重新编程之外，科学家们还在线虫、果蝇、植物甚至小鼠中进行了测试。 Chin、剑桥大学的神经科学家Michael Hastings 及其同事利用扩展的遗传密码在小鼠体内创建了翻译调节开关。脊髓上核（SCN）是哺乳动物的主要生物钟，协调生理和行为的日常节律。昼夜节律围绕自我维持的转录翻译负反馈环路(TTFL) 展开，其中CLOCK 和BMAL1 驱动负调节因子period 和Cryptochrome (Cry) 的表达。 Cry1 和Cry2 的整体删除使TTFL 无效，导致下游行为心律失常。作者将携带琥珀终止密码子的Cry1蛋白构建到由Cry启动子控制的腺相关病毒（AAV）载体中，该载体可以整合炔基赖氨酸N6-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-赖氨酸正交氨酰基-tRNA氨基酸合成酶/tRNACUA (AlkK)被构建到另一个AAV载体中，其中氨酰基-tRNA合成酶由神经元特异性突触蛋白依赖性启动子控制。通过脑内注射将两种AAV 递送至Cry 缺陷小鼠的SCN，将其用作打开和关闭小鼠脑细胞中基因的开关。由于小鼠无法自行合成AlkK，因此研究人员可以通过在啮齿类动物的饮用水中添加或去除AlkK 来控制其昼夜节律。

Cry1 表达的翻译调节开关调节小鼠昼夜节律

扩展遗传密码在医学领域的应用也正在积极开展。蛋白质与其他分子之间的相互作用通常是相对较弱的非共价结合。转换为共价结合可能会增强蛋白质的有效性。因此，加州大学旧金山分校（UCSF）的化学生物学家王磊正在开展如何与生物分子相互作用的研究。共价连接的蛋白质药物。 2020年，王雷团队开发了PERx（proximity-enabled reactivity）处理技术。蛋白质药物中隐藏的生物活性非天然氨基酸稳定存在于蛋白质和细胞中。然而，当蛋白质药物与目标蛋白质中的某些天然物质相互作用时，当氨基酸残基足够接近时，就会发生化学反应。作者早期发现非天然氨基酸氟磺酸盐-L-酪氨酸(FSY) 可以与附近的组氨酸、酪氨酸或赖氨酸发生点击化学氟化硫交换反应(SuFEx)。作者将FSY 引入免疫检查点蛋白PD-1 中，从而创造出一种抗肿瘤药物。通常，T 细胞上的PD-1 和肿瘤细胞上的PD-L1 之间的相互作用会抑制免疫反应，使肿瘤逃避免疫监视。当作者将含有FSY 的PD-1 注射到植入人类癌细胞的小鼠体内时，该蛋白质与PD-L1 形成不可逆的共价键，阻断了T 细胞表面PD-L1 与PD-1 的相互作用。导致肿瘤缩小，效果与阻断PD-L1抗体相当或更好。 Enlaza Therapeutics获得了UCSF对该共价治疗技术的独家授权，并于2022年12月15日完成6100万美元种子融资后正式上线。王雷担任该公司的科学顾问。官网并未透露管道信息。

通过PERx技术开发共价蛋白药物

参考来源：

梅伍德，伊丽莎白·S.艾略特，托马斯·S.巴顿，安德鲁·P。克罗格，托克·P.切舍姆，约翰娜·E.恩斯特，拉塞尔·J.瓦茨拉夫·贝拉内克；布兰卡乔，马可；贾森·W·钦；迈克尔·黑斯廷斯(2018)。 Cry1 蛋白表达的翻译转换赋予心律失常Cry 缺陷小鼠昼夜节律行为的可逆控制。美国国家科学院院刊，()，201811438。 doi:10.1073/pnas.1811438115Li，杰克·C.刘涛；王艳；梅塔，Angad P.彼得·G·舒尔茨(2018)。利用基因编码的非规范氨基酸增强蛋白质稳定性。美国化学会杂志，()，jacs.8b07157 。 doi:10.1021/jacs.8b07157李庆科；陈曲；保罗·C·克劳瑟；李梦媛；郑峰；王楠溪；李晓英；张千兵；付雪梅；王谦；徐阳；王雷（2020）。通过邻近反应疗法开发共价蛋白药物。电池，()，S0092867420306231。 doi:10.1016/j.cell.2020.05.028Enlaza 治疗|共价蛋白生物制剂|主页(enlazatx.com)